Seminarios de Biología Celular:
"PRIONES, SOLUCIÓN A UN ENIGMA MÉDICO"

Autor: Silvia Pastor Torregrosa.
Curso: 1º Bioquímica. Licenciatura de Bioquímica. Facultad de Ciencias Experimentales.
Fecha: Enero 1999.


INTRODUCCIÓN

En 1982 Stanley B. Prusiner propuso el nombre de prion al agente vinculado a un grupo de desórdenes degenerativos del sistema nervioso central, que comparten características patológicas crónicas y progresivas.

Descubrimiento:

En 1957, Carleton Gajdusek trabajaba como científico visitante en Australia estudiando genética viral e inmunología. Su interés por los problemas médicos de las culturas nativas lo habían llevado a las cercanías de Nueva Guinea para, lo que él esperaba, sería una visita breve antes de regresar a casa en Estados Unidos. Un par de días después de su llegada a Nueva Guinea, Gajdusek habló con Vincent Zigas, médico local, quien le habló acerca de una misteriosa enfermedad que causaba más de la mitad de las muertes entre los pobladores de unas remotas montañas de la isla. Los nativos llamaban a la enfermedad kuru, que significaba "sacudidas o temblores", debido a que en las primeras etapas, las víctimas presentaban temblores involuntarios. En los siguientes meses, las víctimas (principalmente mujeres y niños), evolucionaban pasando por etapas de debilidad creciente, demencia y parálisis, que finalmente acababa con sus vidas. Gajdusek decidió abandonar sus planes de viaje y permanecer en Nueve Guinea para estudiar la enfermedad.

Al escuchar los síntomas de la enfermedad, Gajdusek concluyó que las personas de la región probablemente sufrían encefalitis viral epidémica. La enfermedad tal vez se propagaba entre la población por la práctica ritual de comer ciertas partes del cuerpo de los parientes muertos. Como en las aldeas las mujeres eran quienes preparaban los cuerpos, tenían la oportunidad de participar en esta forma de canibalismo y serían ellas las que estuvieran en mayor peligro de contraer la infección. En los meses subsecuentes, Gajdusek efectuó autopsias de los pacientes muertos y preparó muestras de tejidos y de líquidos para enviar a los laboratorios de Australia. Los cortes de cerebro revelaron que las víctimas de kuru morían como resultado de un extenso proceso degenerativo en el cerebro.

Se comenzaron a acumular pruebas de que el kuru no era una enfermedad viral. Los pacientes muertos de kuru no presentaban ninguno de los síntomas que normalmente acompañan a las infecciones del sistema nervioso central, como fiebre, inflamación encefálica y cambios en la composición del líquido cefaloraquídeo. Además, los mejores laboratorios de Australia no pudieron cultivar agente infeccioso alguno en las muestras de tejido enfermo.Gajdusek empezó a considerar explicaciones alternativas como causa del kuru. Había la posibilidad de que los aldeanos muertos se hubieran expuesto a algún tipo de sustancia tóxica en su dieta. Se efectuaron análisis de sangre con la esperanza de hallar concentraciones elevadas de metales, grasas, o de otras toxinas comunes, pero no se encontró anomalía clínica alguna.

En este punto, Gajdusek, pensó que el kuru podría ser una enfermedad hereditaria, pero a partir de comentarios con los genetistas, concluyó que era muy improbable. Por ejemplo, para una enfermedad hereditaria, sería prácticamente imposible lo siguiente:

No parecía haber una explicación razonable a la causa del kuru.

Por otro lado, William Hadlow, veterinario patólogo estadounidense, había trabajado sobre una enfermedad neurológica degenerativa llamada scrapie (encefalitis espongiforme), común en ovejas y cabras. En 1959, Hadlow visitó una exposición en Londres donde vio muestras de neuropatología preparadas por Carleton Gajdusek de una persona muerta de kuru. Hadlow quedó impresionado por el notable parecido entre las anomalías de cerebro de las víctimas de kuru y las observadas en cerebros de ovejas muertas por encefalitis espongiforme. Se sabía que la encefalitis espongiforme era causada por un agente infeccioso; esto se había demostrado por transmisión de la enfermedad a ovejas saludables inyectándoles extractos preparados de animales muertos. El agente causal del scrapie era capaz de atravesar filtros que retardaban el paso de bacterias, y por esa razón se asumió que se trataba de un virus. Sin embargo, a diferencia de otras enfermedades virales, los síntomas del scrapie no aparecían sino después de meses que el animal se había infectado con el patógeno, por lo que se le dio el nombre de "virus lento". Hadlow concluyó que el kuru y la encefalitis espongiforme eran causadas por el mismo tipo de agente infeccioso y publicó su especulación en la revista Lancet. Después de leer la carta publicada y de hablar con Hadlow, Gakdusek quedó convencido de que su primera idea acerca del kuru como enfermedad infecciosa era correcta. Tras varios años de trabajo, finalmente Gajdusek pudo demostrar que el kuru se transmitía por extractos de tejido humano a primates de laboratorio. El período de incubación entre la inoculación de los animales y la aparición de los síntomas de la enfermedad era de casi dos años. El kuru vino a ser así, la enfermedad humana en la cual se demostró que la causa era un virus lento.

Varios años antes, Igor Klatzo, neuropatólogo, había dicho a Gajdusek que una rara enfermedad hereditaria llamada de Creutzfeldt-Jakob (CJD) producía anomalías en el cerebro que recordaban las del kuru. Tres años después de haber confirmado que el kuru podía transmitirse del hombre a los animales, Gajdusek y sus colaboradores demostraron mediante extractos preparados por biopsia del cerebro de una persona muerta por CJD que ésta podía transmitirse a los animales. También había varios casos comprobados en los cuales la CJD era transmitida de un ser humano a otro durante procesos quirúrgicos, como transplante de córneas, o extractos de hormona de crecimiento preparada a partir de glándula hipófisis de cadáveres.

¿Cómo se podía vincular una enfermedad hereditaria, como la CJD, con la presencia de un agente infeccioso?. La respuesta a esta pregunta se ha revelado en los últimos quince años, principalmente a través del trabajo de Stanley Prusiner y sus colegas de la Universidad de California, en San Francisco. Prusiner comenzó estudiando las propiedades del agente causal de la encefalitis espongiforme y pronto llegó a dos conclusiones estimulantes:

  • El agente era muy pequeño, mucho más que cualquier virus conocido, con un peso total de 27.000 a 30.000 daltons.
  • Al parecer el agente carecía de un ácido nucleico entre sus elementos, y estaba compuesto exclusivamente de proteínas.
  • Esta segunda conclusión se basaba en el tratamiento exhaustivo de extractos de cerebros infectados con enzimas y otras sustancias capaces de digerir o destruir proteínas o ácidos nucleicos. El tratamiento con enzimas destructoras de proteínas, como enzimas proteolíticas o fenol, producía extractos inofensivos, en tanto que el tratamiento con agentes destructores de ácidos nucleicos, incluyendo diferentes tipos de nucleasas y radiación ultravioleta, no mostraba efecto alguno sobre la infecciosidad.

    La resistencia del agente de la encefalitis espongiforme a la radiación ultravioleta se muestra en el siguiente cuadro. Prusiner llamó al agente causal de la encefalitis espongiforme, y presumiblemente, también del kuru y de la CJD, un prión, derivado de partícula proteinácea infecciosa.

    Tabla 1. Inactivación de agentes infecciosos pequeños por radiación UV a 254nm


    Ejemplo D37(J/m2)*
    Bacteriófago T2
    4
    Bacteriófago S13 20
    Bacteriófago f X174 20
    Virus del sarcoma de Rous 150
    Poliomavirus 240
    Virus de la leucemia de Friend 500
    Virus de la leucemia murina 1400
    Viroide de los tubérculos fusiformes de la patata 5000
    Agente del "scrapie" (encefalitis espongiforme) 42000
    *D37 es la dosis de radiación que permite una supervivencia del 37%.

    Figura 1. Inactivación de agentes infecciosos pequeños por radiación UV.

    La evidencia de que las proteínas pueden transmitir una enfermedad infecciosa, causó sorpresa entre la comunidad científica. A comienzos de 1996, autoridades británicas señalaron una posible asociación entre la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) y una variante de la enfermedad de Creutfeld-Jacob. Posterior a la epidemia de BSE, en abril de 1996 un grupo de expertos de la OMS declaró que no hay una relación directa y definida entre ambas enfermedades, pero que algunos casos debían investigarse por ofrecer indicios indirectos.

    Cuadro resumen: HISTORIA PRIÓNICA.

    • 1920. Creutzfeldt describe por vez primera una demencia progresiva en una mujer de 22 años. 
    • 1921. Jakob refiere hallazgos similares en cuatro casos, y desde entonces se define la enfermedad descrita por estos dos científicos (CJD). 
    • 1954. Sigurdsson introduce en concepto de infecciones lentas (Prusiner corrige más tarde señalando que no están producidas por ningún agente infeccioso sino por priones). 
    • 1959. El grupo de Klatzo observa similitudes histopatológicas entre el kuru y CJD. Hadlow describe este mismo parecido pero con el Scrapie. 
    • 1960. El grupo de Gajdusek logra transmitir experimentalmente a monos la enfermedad de CJ. 
    • 1976. Daniel Gajdusek (junto a Baruch Blumberg) es galardonado con el Nobel de Medicina por sus aportaciones al conocimiento de las enfermedades infecciosas provocadas por virus de acción lenta. 
    • 1982. Stanley Prusiner identifica el prión en un hámster. 
    • 1997. Prusiner recibe el premio Nobel de Medicina por su descubrimiento de los priones.

    Descripción:

    Los priones están constituídos por partículas proteínicas carentes de DNA, pudiendo, por tanto, replicarse sin genes. Se estima que el agente es más pequeño que la mayoría de los virus, y muy resistente al calor, a los rayos ultravioletas, a la radiación ionizante y a los desinfectantes comunes que, habitualmente, inactivan a los virus.

    El agente no causa reacciones inflamatorias o inmunitarias detectables ni se ha observado al microscopio. No se dispone de pruebas para la detección en seres vivos, salvo el estudio patológico.

    Los priones causan una variedad de enfermedades neuronales degenerativas que pueden ser infecciosas, heredadas o esporádicas en origen.

    La PrPc, es sintetizada en el retículo endoplasmático, modificada en el Aparato de Golgi y transportada a la superficie celular donde se une a un glicofosfatidil inositol (GPI). Como otras proteínas unidas a GPI, la PrPc parece reintroducirse en la célula a través de compartimentos subcelulares por moléculas de colesterol. La no unión de GPI hace disminuir fuertemente la síntesis de PrPsc.

    El prión, proteína codificada por un gen celular, presenta dos isoformas: normal (PrPc) y patológica o infecciosa (PrPcs). La isoforma normal ha sido descubierta en tejidos de mamíferos, entre ellos ovinos, bovinos, hamster, ratón visón, y en humanos, con un 80-90% de homología entre las secuencias de PrP en las diferentes especies. Se acepta que la secuencia de PrPc determina que haya una barrera interespecies para las Encefalopatías Espongiformes Transmisibles, que para el caso de la forma bovina puede haber sido superada por el agente causal del Scrapie. En efecto, la secuenciación de los genes de los priones de ovino y bovino dejan ver una homología del 98% entre ambas proteínas, lo cual permitiría explicar el pasaje de la barrera entre especies.

    Se ha propuesto la hipótesis de diferencias genéticas en la susceptibilidad para explicar la aparición de la enfermedad en familias, con un patrón semejante de los rasgos dominantes autosómicos. En animales se han identificado diferencias genéticas en la susceptibilidad al Scrapie. Se ha observado relación entre las mutaciones con el gen "proteína prión" y la enfermedad de CJ en familias y el Síndrome de Gerstmann-Straussler (GSS).

    La idea de un patógeno infeccioso constituído exclusivamente de proteínas fue vista con gran escepticismo, pero estudios subsecuentes de Prusiner y otros, no han demostrado manera alguna de modificar la conclusión original. En 1985 se demostró que la proteína prión es codificada por un gen situado dentro de los propios cromosomas de la célula. El gen se expresa en el tejido cerebral normal y codifica una proteína de 254 aminoácidos designada PrPc (proteína prión celular), cuya función aún se desconoce. Una forma modificada de la proteína designada PrPsc (proteína prión scrapie) se encuentra en el cerebro de animales con Scrapie. A diferencia de la PrPc normal, la versión modificada de la proteína se acumula dentro de las células nerviosas formando agregados que, aparentemente, matan a las células. La PrPsc no sólo provoca los cambios degenerativos del Scrapie en el cerebro sino también se presume que es el agente infeccioso capaz de transmitir la enfermedad de un animal a otro.
    PrPc es una proteína anclada a la superficie externa de neuronas y, en menor medida, a linfocitos y otras células. Se han creado ratones homocigóticos con los genes de PrP modificados. Sorprendentemente, estos ratones se han desarrollado y comportado normalmente durante al menos siete meses.


    ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR PRIONES

    En animales, las enfermedades más conocidas son:

    Encefalopatía espongiforme bovina (BSE), ("Vacas locas").

    Scrapie (ovejas).

    Encefalopatía transmisible (visones).

    Enfermedades crónicas de desgaste (mulas, ciervos, alces).

    Los humanos son susceptibles a varias enfermedades vinculadas a priones: Enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (CJD).

    Síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheiner (GSS).

    Kuru.

    Insomnio fatal familiar (FFI).

    Síndrome de Alpers.

    Periodo de incubación:

    La fase de incubación o período asintomático se estima que puede ser prolongada, en algunos casos hasta 20 años. La fase de enfermedad declarada, es una fase avanzada, desde que aparecen los síntomas con rápida progresión hasta la defunción en el período de un año, en promedio. En la enfermedad CJ hay pronta sucesión de apatía, pérdida de memoria, demencia permanente, incoordinación neuromotriz y pérdida del habla.


    MODO DE TRANSMISIÓN

    Algunas enfermedades por priones humanos están vinculadas a factores mendelianos dominantes, debidas a mutaciones en el gen PrP, que se han observado en diferentes familias.

    Se ha observado transmisión iatrogénica (por medicamentos y tratamientos médicos) de CJD de un paciente a otros a través del uso de electrodos cerebrales, transplantes de córneas, injertos de duramadre o inyecciones de hormona del crecimiento. Hay evidencias de estudios in vivo e in vitro de que las proteínas normales pueden desencadenar cambios en la conformación de las proteínas del huésped, produciendo la enfermedad.

    En el caso de la enfermedad del Kuru se ha demostrado la transmisión por vía oral, por prácticas de canibalismo en Nueva Guinea. Desde 1950 no se observan nuevos casos al haber sido abolida esta práctica.

    La mayoría de las evidencias sugieren que no hay transmisión vertical (por herencia) de enfermedades por priones. La transmisión horizontal (por infección), a parte de los mecanismos de inoculación, no suele ocurrir en la inmensa mayoría de los casos. La transmisión por transfusión sanguínea no ha sido demostrada, sin embargo, algunos centros excluyen como donantes de sangre a personas que padecen de CJD.

    Hay diferencias genéticas entre proteínas/priones de diferentes especies que actúan como barreras para la transmisión. En situaciones experimentales se ha logrado la transmisión cruzada. GSS ha sido transmitida a monos y roedores por inoculación intracerebral. FFI puede ser transmitido a ratones por inoculación. BSE ha sido adquirida en el ganado bovino expuesto a Scrapie en alimentos, y en otros animales por inoculación. La encefalopatía espongiforme felina apareció por primera vez en 1990 y se atribuyó a transmisión oral de BSE a gatos.

    No se conoce con exactitud cómo la propagación de PrPsc daña las células. En cultivos celulares la conversión ocurre dentro de las neuronas, y la PrPsc se acumula en vesículas intracelulares conocidas como lisosomas. Éstas podrían reventar y dañar las células del cerebro.

    Lo más revolucionario en la teoría del profesor Prusiner es que los priones responsables de las encefalopatías espongiformes, son proteínas que todos, animales y humanos, afectados o no por la enfermedad transportamos en nuestro organismo. La única diferencia entre los priones sanos y enfermos es que, en estos, su estructura se pliega de forma distinta. Aún no se sabe cómo la proteína enferma contamina a la proteína normal cuando se acerca hasta ella. Se piensa que existen otros cofactores aún no identificados que podrían facilitar esta acción patológica. Incluso podría decirse que los priones enfermos fabrican camas o moldes a la medida de la enfermedad, moldes en los que "caen" los priones naturales para, posteriormente, aparecer con la estructura patológicamente modificada.

    Después de descubrirse que el Scrapie podría ser el resultado de la modificación del producto de un gen normal, fue posible explicar cómo una enfermedad genética, como la de CJ, podía transmitirse de un individuo a otro. Casi todos los genes presentes en el ser humano también lo están en otros mamíferos y, por lo tanto, hay una versión humana del PrP. Presumiblemente, si este gen humano sufre algún tipo de mutación, produciría una proteína PrPsc análoga a la proteína modificada de la oveja en cuanto a su actividad.

    La propagación del prión, está adscrita a la conversión de la PrPc a PrPsc bajo la influencia de ésta última.

    Estudios con ratones transgénicos indican que la PrPc es convertida más eficazmente en PrPsc cuando la secuencia de aminoácidos de una y otra son idénticas. Ratones portadores de un gen PrP con una mutación de la Pro102 a Leu (lesión genética asociada a GSS) desarrolla un desorden neurodegenerativo indistinguible del Scrapie experimental y que produce priones de novo. Ratones en los cuales ha sido eliminado el gen salvaje PrP son resistentes al Scrapie y no producen priones, confirmando que una fuente de PrP es necesaria para la transmisión y patogénesis de la enfermedad.

    Figura 2. Transmisión entre especies (when prions are transmitted from one species to another disease develops only after a very long incubation period, if at all, but on serial passage in the new species the incubation time often decreases dramatically and then stabilises. This species barrier can be overcome by introducing a PrP transgene from the prion donor i.e. hamster PrPc but not murine PrPc is a suitable substrate for conversion to hamster PrPsc by hamster prions and vice versa):

    Formación de la PrPsc:

    La PrPsc podría ser formada por modificaciones químicas posttraslacionales, pero dichas modificaciones no han sido detectadas. Estudios estructurales recientes han demostrado que la PrPc y PrPsc difieren en la conformación. Ambas isoformas han sido purificadas y determinada su estructura secundaria por dicroismo circular. Se encontró que PrPc tenía un alto porcentaje de hélices a (42%) y prácticamente ninguna lámina b (3%), mientras que la PrPsc tenía un 43% de lámina b y un contenido en hélices a del 30%. Ni PrPc ni PrPsc formaban agregados detectables por microscopio electrónico.

    A pesar de que todavía no ha sido posible obtener cristales de PrPc o de PrPsc por técnicas de rayos X, ha sido deducida, por un método informático, la estructura terciaria para la PrPc. Se encontraron cuatro supuestas regiones de estructura secundaria que permitieron asignar a hélices a en la PrP. Se crearon péptidos sintéticos correspondientes a estas regiones y tres de las cuatro correspondieron a láminas b en medio acuoso y polimerizaban a modo de varillas por técnicas de las propiedades tintoriales amiloides. Esta incongruencia podría indicar que PrPc contiene dominios que podrían adquirir más de una conformación. Se generó un modelo plausible para la estructura terciaria de la PrPc examinando todos los modos posibles por los que las cuatro supuestas a-hélices podían constituir una estructura globular compacta.

    Figura 3. Estructura de los priones ( Dr. Thomas Pringle of the Sperling Foundation Official Mad Cow Disease Home Page).

    La PrPc, debido a determinadas mutaciones, podría transformarse en una conformación mayoritaria en láminas b provocando la agregación de estas proteínas que se irían acumulando en los lisosomas produciendo, finalmente, la encefalopatía.

    Estos descubrimientos estructurales sugieren un modelo conformacional para la replicación de los priones que, en principio podría explicar la patogénesis de las formas infecciosas, hereditarias y esporádicas de la enfermedad del prión. De acuerdo con este modelo, las fluctuaciones en la estructura de PrPc podrían generar un monómero parcialmente desplegado (PrP*) que es un intermediario en la formación de PrPsc. PrP* puede revertir a PrPc, degradarse o formar PrPsc. Normalmente la concentración de PrP* sería baja y PrPsc formaría cantidades insignificantes. Se desconoce si la formación de PrPsc implica la oligomerización, ya que la insolubilidad de ésta hace imposible el análisis de su estado físico.

    En el caso de las enfermedades priónicas infecciosas, los priones exógenos que contuvieran PrPsc actuarían como plantillas para promover la conversión de PrP* a PrPsc (Fig A). La insolubilidad de la PrPsc haría el proceso irreversible y conduciría a la formación de PrP* (y PrPsc) por acción masiva. En el caso de enfermedades priónicas heredadas, las mutaciones de PrP (D) desestabilizarían la D PrPc y promovería su conversión a D PrP* que aumentaría la probabilidad de formación de D PrPsc (Fig B). La información actual sobre la localización de las mutaciones consiste en esta hipótesis. Diez u once puntos de mutación, que segregan con enfermedades hereditarias de priones, ocurren dentro o cerca de las cuatro supuestas hélices a, y cinco grupos de mutaciones rodean una cavidad central que podría ser esencial para la estabilidad de PrPc.

    Finalmente, las enfermedades priónicas esporádicas resultan de raras ocasiones en las cuales hay suficiente acumulación de PrP* para producir PrPsc (FigA). En apoyo a esta propuesta, está el hecho de que los ratones transgénicos que sobreexpresan el tipo salvaje del gen PrP desarrollan degeneración espongiforme y producen priones. Alternativamente, las enfermedades priónicas esporádicas deben producirse por mutaciones somáticas que desestabilizan la PrPc y promueve su conversión a PrPsc a través de PrP*. Algo a destacar es el común polimorfismo de Met/Val en el aminoácido 129 en el PrP humano, este aminoácido se sitúa en el extremo amino-terminal de la segunda supuesta a hélice en la PrPc, pero se encuentra al final de una lámina b en la PrPsc. La homocigosidad en el codón 129 parece predisponer a CJD esporádica lo que indica que este residuo debe situarse en una interfase multimérica uniendo dos láminas b . Estudios de otras proteínas sugieren que Met/Met y Val/Val son vecinos comunes en láminas b, mientras que la yuxtaposición Met/Val es inusual. Pacientes con mutaciones de Asp178 a Asn sufren de insomnio si el codón 129 especifica Met en el alelo mutante, o presentan demencia si el codón 129 especifica Val.

    La transmisión de priones de unas especies a otras se acompaña de un período prolongado de incubación. Se ha observado que la "barrera interespecie" es debida a diferencias en la secuencia de PrP. Las diferencias en el tiempo de incubación también se han observado en diferentes tipos de ratones; estas diferencias en ratones con cortos y largos períodos de incubación difieren en la posición de dos nucleótidos. Cuando los priones se introducen en ratones con una secuencia no complementaria de PrP, el tiempo de incubación es mayor que cundo se trata de una secuencia complementaria. Estas interacciones entre diferentes moléculas de PrPc y PrPsc parecen tener una profunda influencia en los tiempos de incubación con diferentes tipos de priones. Se desconoce si los distintos tipos de priones representan diferentes conformaciones de PrPsc.

    El modelo planteado aquí sobre el modo de transmisión, sugiere que estas enfermedades podrían ser prevenidas o tratadas mediante intervenciones que estabilizaran las supuestas hélices a y de este modo inhibir su conversión a láminas b.


    DETECCIÓN DE PrPsc

    No se ha observado en tejido cerebral humano o animal PrPsc sin enfermedad priónica. Esto permite utilizarla como marcador de diagnóstico patológico. El Western Blot es una buena técnica, sensible y específica para la detección de PrPsc después de digerirlo con proteinasa K en homogeneizados cerebrales. Se extrae la proteína y se separa por electroforesis en gel de poliacrilamida. Se transfiere a una membrana de nitrocelulosa y se realiza un enzimoinmunoensayo.

    La inmunohistoquímica puede detectar PrPsc en secciones de tejido embebido en parafina, fijado con formalina, usando varios pretratamientos. Entre estos, el más simple y efectivo para la tinción de la proteína, así como de otros depósitos amiloides, es el tratamiento con 90-100% de ácido fórmico de secciones desparafinadas.

    Tabla 2. Estabilidad a tratamientos químicos y enzimáticos (Stabilities of the scrapie agent and viriods, PSTV).

     Chemical Treatment Concentration PSTV Scrapie
    Et2PC 10-20mM (-) +
    NH2OH  0.1-0.5mM + -
    Psoralen 10-500µg/ml + -
    Phenol Saturated - +
    SDS 1-10% - +
    Zn2+ 2mM + -
    Urea 3-8M - +
    Alkali pH 10 (-) +
    KSCN 1M - +
    Enzymatic Treatment Concentration PSTV Scrapie
    RNAse A 0.1-100µg/ml + -
    DNAse 100µg/ml - -
     Proteinase K 100µg/ml - +
     Trypsin 100µg/ml - +
     + = inactivated; - = no change in infectivity



    ESTUDIOS RELACIONADOS

    El análisis del DNA aislado de cierto número de pacientes humanos con CJD, reveló la presencia de mutaciones específicas en el gen que codifica PrP. En los últimos años, el análisis genético de la susceptibilidad a enfermedades causadas por priones depende de ratones sometidos a procesos particulares de ingeniería

    genética. Se han desarrollado dos tipos de ratones modificados: unos que carecen por completo del gen PrP (a los cuales se les denomina ratones "knock-out" de PrP) y otros que contienen una o más copias de la forma mutada del gen PrP humano (a los que se les da el nombre de ratones transgénicos PrP).

    Puesto que la proteína PrP se produce normalmente en el cerebro (y otros órganos de los ratones), podría esperarse que la ausencia del gen causara consecuencias terribles en el desarrollo de la conducta de ratones carentes de PrP. Sin embargo, a pesar de esta expectativa, los ratones "knockout" que carecen del gen PrP no muestran los efectos de la enfermedad. Hay varias explicaciones razonables para este resultado, incluyendo la posibilidad de que la función normal de la proteína PrP sea sustituída por otra proteína producida por un gen relacionado; en otras palabras, el ratón tiene un sistema "de respaldo" que puede dispensar a la proteína PrP. De cualquier manera, los ratones que carecen del gen PrP y por lo tanto no pueden sintetizar proteína PrPc, no desarrollan el Scrapie cuando se inyectan en su cerebro priones de ratones con Scrapie. Así pues, para que un ratón sea susceptible a la enfermedad, el animal debe ser capaz de producir la proteína PrP en sus propios genes; no es suficiente que se introduzca en su cuerpo la proteína anormal. Estos datos apoyan la hipótesis de que la proteína PrP es indispensable para la propagación del prión durante la infección. También se han efectuado estudios empleando ratones transgénicos, es decir, ratones sometidos a ingeniería genética para que sean portadores de genes extraños entre sus cromosomas. Cuando se transfiere a los ratones un gen PrP humano mutado, los animales transgénicos desarrollan el mismo tipo de enfermedad cerebral neuropatológica como la observada en el hombre. Este experimento demuestra que la presencia de un solo gen mutado, que codifica una sola proteína anormal, es suficiente para causar todos los síntomas que acompañan a la devastadora enfermedad neurológica.

    Ausencia de propagación de priones en ratones carentes de PrP:

    La infectividad en el cerebro fue determinada en dos experimentos de marcaje distintos. Los animales de fenotipo salvaje inoculados con Scrapie revelaron una concentración de priones de 105.4- 107.7 LD50 U/g en tejido cerebral de unas ocho semanas y de 107.7- 108.6 LD50 U/g de unas veinte semanas. En el caso de animales carentes de PrP inoculados con Scrapie, los homogeneizados cerebrales tomados a las 2, 8, 12 y 25 semanas después de la inoculación, no mostraron infectividad. En una única prueba, un homogeneizado de cuatro cerebros preparados 20 semanas después de la infección tuvieron un bajo grado de infectividad, sobre 103 LD50 U/g. La explicación más probable fue la contaminación; de cualquier modo, los bajos niveles de propagación del agente del Scrapie tuvieron que ser considerados.

    Se reensayaron las muestras de 20 semanas de este experimento y se confirmó la infectividad encontrada previamente (exp.1). Además se hicieron ensayos en ratones knockout de PrP del mismo experimento 25, 33 y 48 semanas después de la inoculación y no se encontró infectividad (exp.1).
     
    Tabla 3. Titration of Scrapie Infectivity in Brain Homogenates of Scrapie-Inoculated PrP0/0 Mice.
    Experiment Time after Inoculation (weeks) Number of Brains Pooled Concentration of Homogenate (%) CD1 Mice with Scrapie Symptoms
    1 20
    20
    25
    25
    33
    33
    33
    48
    48
    4
    4
    4
    4
    Single
    Single
    Single
    Single
    Single
    5
    1
    5
    1
    5
    5
    5
    5
    5
    6 of 6a
    5 of 6b
    0 of 5
    0 of 6
    0 of 4
    0 of 5
    0 of 6
    0 of 5
    0 of 6
    2 16
    18
    20
    20
    20
    20
    22
    4
    4
    Single
    Single
    Single
    Single
    4
    1
    1
    1
    1
    1
    1
    1
    0 of 8
    0 of 8
    0 of 8
    1 of 8c
    0 of 8
    0 of 8
    0 of 9

    Se repitió el experimento completo, inoculando priones Scrapie de ratones a diferentes grupos de ratones knockout de PrP y se midió la infección de homogeneizados cerebrales a las 16, 18, 20 y 22 semanas después de la inoculación (exp.2). Las muestras de 16, 18 y 22 semanas no mostraron infectividad por Scrapie. Para la semana número 20, cuatro cerebros aislados de cada ratón fueron contabilizados con el marcador 8. De 32 animales, uno mostró síntomas de Scrapie a los 261 días; sin embargo, el resto se mantuvieron saludables durante más de 300 días cuando el experimento finalizó. Bajo la improbable suposición de que el cerebro contaminado no fuera por causa de la contaminación, esto representaría un contenido medio de alrededor de 20 LD50 unidades por cerebro. Como cada animal fue inoculado con unas 107 LD50 unidades, está claro que los priones no se propagaron en ausencia de PrP. Prusiner et al, usando el mismo tipo de ratones, también falló en encontrar propagación del agente infeccioso.

    Transmisión hombre-animal:

    Desde mucho laboratorios de investigación se ha demostrado que es posible trasvasar enfermedades priónicas humanas a animales y también inducirlas experimentalmente. Del mismo modo, por si hubiera alguna duda, la encefalopatía espongiforme bovina se ha visto que es capaz de "transformarse" en CJD cuando los priones animales se introducen en el cuerpo humano.


    ENFERMEDADES RELACIONADAS

    Algunos autores consideran que los priones pueden tener algún efecto en enfermedades como Alzheimer, Parkinson, Esclerosis lateral amiotrófica, Huntington, y otras, que presentan algunas similitudes:

    El profesor Cacabelos, director del Centro de Investigación Biomédica Euroespes (CIBE), en La Coruña, escribe que "las encefalopatías espongiformes siempre han estado ligadas de algún modo a la enfermedad de Alzheimer y que, en ocasiones, es imposible distinguir la enfermedad de CJ de la enfermedad de Alzheimer sólo por motivos clínicos".

    El prión es una pequeña partícula proteinácea infectiva resistente a la inactivación por procedimientos que modifican a los ácidos nucleicos y son sinónimo del agente del Scrapie. Se ha postulado que la enfermedad de Alzheimer podría estar causada por un virus lento o por priones como los responsables del Kuru, el Scrapie -sólo afecta a ovinos y murinos-, el GSS y CJD (encefalopatía espongiforme bovina, cuando afecta a las vacas).

    Otra de las similitudes entre la enfermedad de Alzheimer y las enfermedades priónicas es la manera en que "dejan" el cerebro: con el aspecto de una esponja, por eso se denominan encefalopatías "espongiformes". Al igual que sucede con los depósitos de b-amiloide en la demencia senil, en CJD, los priones también generan unas placas que se depositan en distintos lugares del cerebro. Dichas placas y, dependiendo del lugar donde se queden, producen desorientación, dificultades para andar, pérdida de memoria, etc. Curiosamente los mismos síntomas que el Alzheimer.


    CONCLUSIONES

    Todas las enfermedades priónicas han sido reproducidas en modelos murinos.

    Hay evidencias científicas e investigaciones múltiples en desarrollo que tratan de determinar si priones de otras proteínas intervienen en procesos neurodegenerativos como las enfermedades de Alzheimer, Parkinson, Huntington, Esclerosis lateral amiotróficas y otras.

    La proteína priónica normal (PrP) puede tener un lugar muy especial en el manejo de la cadena de eventos. PrPc es crucial para la propagación dentro del SNC, probablemente sea requerida también en sitios específicos del SNC. Si esto se confirma puede surgir una oportunidad para impedir la diseminación de priones y, por lo tanto, para la prevención secundaria de encefalopatías, después de la exposición a priones. Hay avances destacados en estos campos, lo cual hace vislumbrar medidas preventivas en un futuro cercano.

    El descubrimiento de que ratones carentes del gen funcional PrP no muestran anormalidades hasta una edad aproximada de 7 meses tiene implicaciones importantes. De todos modos, no está claro si la patología del Scrapie es debida a una reducción de la PrPc normal o por la acumulación de PrPsc en neuronas infectadas. El hecho de que los ratones puedan vivir normalmente durante al menos siete meses sin expresar PrPc va en contra de la hipótesis de la reducción de PrP, aunque son necesarias más observaciones para confirmarlo. La posibilidad de criar ratones carentes de PrPc nos permite estudiar la propuesta de que la PrPc es esencial no sólo para patologías asociadas a enfermedades semejantes a Scrapie sino también para la formación del agente infeccioso. Además, la disponibilidad de ratones PrP0/0 nos proporciona un mejor acercamiento al análisis de genes PrP mutados o extraños. La introducción de genes PrP exógenos en ratones PrP0/0 ya sea por apareamiento con ratones transgénicos o por inoculación directa del gen, permitirá estudiar el efecto de diferentes alelos mutantes y normales sin las interferencias de genes endógenos.

    ¿Deberían ser resistentes, los ratones carentes de PrPc, a la infección por Scrapie?. Si la prescindibilidad de estos genes es un fenómeno general, debería ser factible obtener ganado resistente a la enfermedad, una posibilidad interesante, no sólo para el manejo de animales sino también para productores y consumidores de productos derivados del ganado empleados para la fabricación de muchos productos biofarmacéuticos. Además, si las encefalopatías espongiformes son debidas a la acumulación de PrPsc, la terapia dirigida a la disminución de la síntesis de PrPc, nos proporcionará una mejora para retardar y mitigar la progresión de la enfermedad, especialmente en las formas familiares donde el tratamiento podría instituirse pronto.


    PREGUNTAS SIN RESPUESTA

    Todavía está sujeta a controversia la idea de que un agente formado por una sola proteína pueda provocar una enfermedad infecciosa. Algunos biólogos opinan que la proteína prión se acompaña de pequeños fragmentos de un ácido nucleico todavía por descubrirse; otros piensan que la proteína prión hace que el individuo sea susceptible a la infección por un segundo agente, por ejemplo un virus, que realmente causa la enfermedad. El desarrollo de la enfermedad en ratones transgénicos por un gen mutante que codifica la proteína prión es un argumento para que la proteína sea la única causa, pero este dato se reforzaría mucho más si se pudiera demostrar que los extractos de cerebro de ratones transgénicos pueden transmitir la enfermedad a ratones normales no transgénicos. En la actualidad, los intentos para transmitir la enfermedad de esta manera sólo han tenido éxito limitado y el asunto todavía permanece confuso.

    Otro tema que permanece sin respuesta es el mecanismo por el cual el agente infeccioso incrementa su número (duplicación) dentro de un individuo afectado, como claramente ocurre. En general sólo se atribuye duplicación a los ácidos nucleicos. ¿Cómo es posible que una proteína produzca más de sí misma?. Esta pregunta sin respuesta todavía es uno de los principales "puntos débiles" en el concepto íntegro de los priones como agentes infecciosos. Prusiner y sus colegas han reunido pruebas que sugieren que las dos versiones de la proteína PrP; PrPc y PrPsc, difieren en su estructura tridimensional (conformación). En otras palabras, la misma proteína puede existir en dos conformaciones diferentes. Según esta hipótesis, la proteína normalmente existe en la forma PrPc. Sin embargo, en el ser humano o los animales, que desarrolla enfermedades prión, se favorece la formación de PrPsc y se acumula la proteína anormal. En el caso de enfermedades infecciosas por prión, como el Kuru o el Scrapie, Prusiner sugiere que la duplicación se inicia cuando una versión Scrapie de la proteína PrP se une a la proteína PrP normal (o una versión no desplegada de la proteína), que transforma la proteína normal en la forma modificada. Por lo tanto, si una molécula PrPsc se une a una PrPc, este hecho generaría dos moléculas PrPsc que podrían entonces enlazarse a dos moléculas más de PrPc produciendo 4 moléculas de PrPsc, y así sucesivamente.

    Otro asunto de interés científico todavía no resuelto es el de la memoria genética. Dicha memoria es una propiedad que se confería únicamente al DNA y RNA celulares. En ellos se almacena la información que luego va pasándose de generación en generación y también la que permite que enfermedades víricas y bacterianas se repliquen y multipliquen rápidamente por el organismo humano. En el caso del prión, su PrP (proteína) guarda esta información sin alterar los aminoácidos que la forman. Simplemente moldea o cambia su forma a su antojo por mecanismos aún desconocidos.

    Finalmente es interesante especular sobre por qué una proteína que se expresa en muchas áreas del cerebro y en otros tejidos, particularmente durante el desarrollo embrionario en todos los mamíferos examinados y en, al menos un ave, podría ser prescindible sin ningún efecto negativo. Una posible explicación es que la función de la proteína perdida sea asumida por otra(s) proteína(s) diferente o relacionada o que tenga una función redundante.


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    (***)Cohen F. E. y cols. 1994. Structural clues to prion replication. Science 264: 530-531.

    (**)Fotocopias Estructura de Macromoléculas.(Enfermedad del prión).

    (*)Priones: solución de un enigma médico. Cap.1. Introducción al estudio de la biología celular.